青霉素不能與氨基糖苷類抗生素、大環內酯類抗生素、四環素類抗生素、氯霉素、磺胺類藥物等合用。青霉素屬于β-內酰胺類抗生素，與某些藥物聯用可能產生拮抗作用或增加不良反應風險，需嚴格遵醫囑使用。
青霉素與氨基糖苷類抗生素如鏈霉素、慶大霉素等合用可能導致藥效降低，兩者混合注射還可能產生沉淀。青霉素的β-內酰胺環易被氨基糖苷類破壞，臨床需分開給藥并間隔一定時間。青霉素與大環內酯類抗生素如紅霉素、阿奇霉素聯用會產生藥理拮抗，大環內酯類抑制細菌蛋白質合成，可能干擾青霉素的殺菌作用。四環素類抗生素如多西環素、米諾環素與青霉素聯用可能影響青霉素對細菌細胞壁的破壞效果，降低治療效果。
青霉素與氯霉素合用可能減弱其抗菌活性，氯霉素作為抑菌劑會阻礙細菌繁殖，使青霉素難以發揮殺菌作用。磺胺類藥物如復方新諾明與青霉素聯用可能增加結晶尿風險，兩者競爭腎臟排泄通道。部分解熱鎮痛藥如阿司匹林可能通過競爭血漿蛋白結合位點影響青霉素血藥濃度。丙磺舒雖可延緩青霉素排泄，但需在醫生指導下調整劑量，避免蓄積中毒。
使用青霉素期間應避免飲酒或含酒精飲料，防止雙硫侖樣反應。服藥期間需觀察是否出現皮疹、呼吸困難等過敏癥狀，過敏體質者用藥前必須進行皮試。建議用藥期間保持充足水分攝入，定期監測肝腎功能，避免與含重金屬離子的藥物或保健品同服。若需聯合用藥，應間隔兩小時以上并咨詢切勿自行調整用藥方案。
